突出

第一次全面表征永生化 T 細胞系 CTLL-2 和 HT-2。

質(zhì)粒電穿孔可實現(xiàn)高效且具有成本效益的 T 細胞工程。

用于 T 細胞電穿孔的優(yōu)化轉基因啟動子和質(zhì)粒結構。

多功能轉基因遞送策略簡化了 T 細胞工程工作流程。

用于精確 T 細胞工程的高效 CRISPR/Cas9 基因組編輯工具包。

摘要

轉基因 T 細胞療法最近的臨床成功凸顯了加速 T 淋巴細胞基礎研究和功能篩選方法的迫切需要。然而，一種簡單且具有成本效益的 T 細胞高效基因工程方法仍然難以捉摸。目前的方法通常依賴于病毒轉導，這是勞動密集型的，需要嚴格的生物安全措施?；谫|(zhì)粒的電穿孔提供了一種經(jīng)濟實惠的替代方案，但在 T 細胞中仍未得到充分探索。此外，原型 T 細胞系的可用性是有限的。在這里，我們通過關注兩種永生化小鼠 T 細胞系 HT-2 和 CTLL-2 來應對這些挑戰(zhàn)，它們概括了原代 T 細胞的關鍵特征，包括細胞毒性和細胞因子依賴性增殖。除了廣泛使用的 Jurkat T 細胞系外，HT-2 和 CTLL-2 還通過在基于比色皿的系統(tǒng)中通過優(yōu)化的電穿孔成功高效地轉染了單個或多個基因。值得注意的是，質(zhì)粒構建體的優(yōu)化能夠遞送高達 6.5 kb 對的目標基因 （GOI） 大貨物，以及通過睡美人轉座子系統(tǒng)將 GOI 穩(wěn)定整合到基因組中。我們還開發(fā)了在永生化 T 淋巴細胞中進行 CRISPR/Cas9 介導的基因編輯的先進方法，實現(xiàn)了高達 97% 的敲除效率和高達 70% 的基于同源定向修復 （HDR） 的靶向敲入效率。我們相信這種基于質(zhì)粒的優(yōu)化電穿孔方法將有助于淋巴細胞生物學基礎研究的進步，并為 T 細胞療法的臨床前研究提供實用、經(jīng)濟高效的工具。

原標題：Plasmid-based electroporation for efficient genetic engineering in immortalized T lymphocytes  通訊作者：Martin Fussenegger

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